Synkanzerogene Wirkung von UV-Strahlung und polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) bei der Entstehung von Plattenepithelkarzinomen - Mechanistische Studie

Status:

abgeschlossen 03/2022

Zielsetzung:

In dem Projekt sollte eine mögliche Synkanzerogenese von UV-Strahlung und Benzo[a]pyren (B[a]P) in zwei verschiedenen Hautmodellen (KeratinoSens^TM-/U937-Zellen und humane ex vivo Haut) mechanistisch untersucht werden. Dafür wurden die Hautmodelle gegenüber verschiedenen B[a]P-Konzentrationen mit/ohne UV-Strahlung exponiert. DNA-Schädigung und -Reparatur, mögliche zugrunde liegende Mechanismen wie oxidativer Stress und Veränderungen der zellulären Stoffwechselwege (Metabolomics) wurden u. a. untersucht. Eine Benchmark-Dosis (BMD)-Berechnung wurde durchgeführt, um den Beginn eines adversen Effektes zu quantifizieren.

Aktivitäten/Methoden:

Exposition: Beide Modelle wurden gegenüber einem B[a]P-Konzentrationsbereich mit/ohne UV-Bestrahlung exponiert, um einen möglichen Übergang von einer adaptiven zu einer adversen zellulären Antwort abbilden zu können.

Methoden:

In vitro

1. Überprüfung der zeit- und dosisabhängigen Aufnahme und Metabolisierung von B[a]P mittels Fluoreszenzspektrometrie;
2. Normierung der Resultate auf lebende Zellen;
3. Überprüfung der Aktivität verschiedener Enzyme (CYP [Cytochrom P450], NQO1 [NAD(P)H Quinone Dehydrogenase]), der Lebensfähigkeit (LDH [Laktatdehydrogenase]), des zellulärer Stoffwechsels (MTT), der Energiebereitstellung (MMP [mitochondriales Membranpotential]), des oxidativen Gleichgewichts (ROS [reaktive Sauerstoffspezies]; Verhältnis reduziertes/oxidiertes Glutathion; Lipidperoxidation; Aktivierung des Keap1-Nrf2-ARE Signalwegs in KeratinoSens^TM-Zellen) und der DNA-Schädigung/-Reparatur (γH2AX [DNA-Reparatur]; Comet [DNA-Schädigung]) in den exponierten Zellen über den gesamten Dosisbereich;
4. Modellierung der Daten (BMD)

Ex vivo

1. CYP450, NQO1
2. LDH, MTT
3. red./ox. Glutathion; Lipidperoxidation
4. γH2AX
5. BMD

Metabolomics

1. Identifizierung regulierter Stoffwechselprodukte mittels untargeted Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS)-Analyse in vitro als Hinweis auf veränderte Stoffwechselwege infolge der Exposition
2. biostatistische/-informatische Auswertung (MetaboAnalyst)

Ergebnisse:

In vitro: Bei beiden Zelllinien hatte B[a]P allein einen geringen Einfluss auf die gemessenen Parameter, während die kombinierte UV- und B[a]P-Exposition teilweise eine synergistische Wirkung zeigte. Die BMD-Werte der meisten Endpunkte lagen zwischen 0,005-0,05 µM B[a]P. Die BMD-Werte für genotoxische Endpunkte lagen bei deutlich niedrigeren B[a]P-Konzentrationen. Die Induktion der DNA-Reparatur (γH2AX) war der empfindlichste Endpunkt mit BMD-Werten von 0,0006 µM B[a]P (KeratinoSens^TM) und 0,001 µM B[a]P (U937).

Ex vivo: In den gemessenen Parametern trat kein synergistischer Effekt auf. Die kombinierte B[a]P/UV-Exposition führte zur niedrigeren γH2AX-Werten gegenüber alleiniger B[a]P-Behandlung und zu höheren Werten gegenüber alleiniger UV-Bestrahlung. Der BMD-Wert für γH2AX nach alleiniger B[a]P-Behandlung lag bei ca. 0,13 ng/cm².

Metabolomics: Die kombinierte Exposition führte zu einer vermehrten Regulation von Stoffwechselprodukten bei niedrigeren B[a]P-Konzentrationen als die alleinige B[a]P-Exposition. Die statistische Analyse zeigte eine klare Trennung der regulierten Metabolite in Abhängigkeit von der Exposition. In KeratinoSens^TM-Zellen gehörten u. a. Glutathion, Adenosinmonophosphat und L-Aspartat zu den Metaboliten, die die bestrahlten und exponierten Zellen am stärksten von den Kontrollzellen diskriminierten. Glutathion ist die wichtigste antioxidative Abwehr, Adenosinmonophosphat und L-Aspartat sind neben anderen Funktionen in der DNA-Synthese involviert.

In beiden Modellen wurde der oxidative Haushalt belastet, allerdings deutlich geringer in der ex vivo Haut. Bzgl. DNA-Schädigung waren die Reaktionen in den Modellen unterschiedlich. In der ex vivo Haut hatte die alleinige B[a]P-Exposition den stärksten Effekt auf die DNA-Reparatur. Die B[a]P + UV-Exposition hatte dagegen geringere Effekte, was unter den untersuchten Versuchsbedingungen für keinen synergistischen Effekt bzgl. der DNA-Schädigung spricht. Hier sind weitere Untersuchungen notwendig.

Stand: