Aufbau einer MALDI-TOF Datenbank zum qualitativen Nachweis von Bakterien in Arbeitsplatzproben

Status:

abgeschlossen 03/2025

Zielsetzung:

Für die qualitative Bakterienuntersuchungen mit der Matrix assisted laser desorption ionization – time of flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) werden Spektren von Bakterienproben mit Referenzspektren aus einer MALDI-Spektrenbibliothek verglichen. Ein sogenanntes Bibliothekspektrum besteht aus einem Hauptspektrum (MSP), das sich jeweils aus vielen einzeln Spektren des jeweiligen Bakteriums zusammensetzt. Die derzeit verfügbaren Bibliothekseinträge sind primär mit Bakterien aufgebaut, die als potenzielle Krankheitserreger medizinisch relevant sind. Für die Identifizierung von Bakterien aus Arbeitsplatzmessungen sind daher nicht immer passende MSP enthalten.

Teil 2 des Projektes MALDI-TOF-MS beschäftigte sich daher mit der Erarbeitung eines Vorgehens zur Erstellung und dem Anlegen einer IFA MALDI-Datenbank, mit dem Ziel, eine auf den Arbeitsplatz zugeschnittene IFA MALDI-Datenbank aufzubauen, zu etablieren und somit den Unfallversicherungsträgern im Rahmen des MGU bereitzustellen. Der Vorteil einer eigenen Datenbank liegt in einer höheren Identifikationsrate im eigenen Labor, einer damit verbundenen Reduzierung von Fremdvergaben bzw. Autarkie gegenüber externen Laboren, was Kosten und Zeit einspart. Die Datenbank soll um solche Bakterien erweitert werden, die in Arbeitsplatzproben (Luft- oder Materialproben) vorkommen und anhand der vorhandenen MALDI-Bibliotheken nicht identifiziert werden können.

Aktivitäten/Methoden:

Anknüpfend an das MALDI-Projekt Teil 1 IFA-2108 bestand das Vorgehen aus folgenden Schritten:

1. Sammeln von Bakterienkolonien aus Arbeitsplatzproben, die nicht mit der vorhandenen MALDI-Bibliothek identifiziert werden konnten (siehe IFA Projekt 2108),
2. Molekularbiologische Untersuchung der nicht zu identifizierenden Isolate,
3. Anreichung des Bakteriums unter verschiedenen Bedingungen,
4. Durchführen von MALDI-Messungen und Zusammenführen aller Spektren zu einen MSP,
5. Validierung des Spektren-Eintrags durch Bakterium der gleichen Art aber unterschiedlicher Herkunft wurde erarbeitet und in einer Arbeitsanweisung festgehalten.

Ergebnisse:

Es wurde eine Arbeitsanweisung entwickelt, auf deren Grundlage 977 Isolate hergestellt wurden, die mit der MALDI-TOF nicht identifizierbar waren, um die IFA MALDI-Datenbank schrittweise aufzubauen. In der Arbeitsanweisung wird dargestellt, wie die Bakterien angezüchtet werden, z. B. kommen zwei verschiedene Nährböden zum Einsatz, um MSP in einer hohen Qualität zu erzeugen. Des Weiteren wurde die Struktur der Datenbank so angelegt, dass neue Einträge einfach implementiert werden können, aber gleichzeitig auch bestehende Einträge schnell zu finden sind. Ferner wurde festgelegt, welche Qualifizierung des MALDI-TOF MS und Validierung des MSP notwendig sind, um belastbare MSP zu erzeugen. Dies beinhaltet z. B. die Massenachsenkalibrierung sowie die Prüfung der Identifizierungsleistung des MALDI-TOFs mittels eines E. coli Standards. Aufgrund der Komplexität der Erstellung von Bibliothekseinträgen ist darauf zu achten, dass Bibliothekseinträge ausschließlich von geschultem Personal erstellt werden.

Die größte Herausforderung stellte die eindeutige Identifizierung der Isolate dar, die für einen Eintrag in der IFA MALDI-Datenbank ausgewählt wurden. Hierfür wurde ein molekulargenetisches Verfahren der Sequenzierung eingesetzt. Wenn mit diesem Verfahren zum Zeitpunkt der Analyse keine Identifizierung möglich war, wird das Bakterienisolat nicht für die Datenbank verwendet. Werden bei zukünftigen Analysen innerhalb des Pools der 977 ausgewählten Isolate Bakterien derselben Art identifiziert, so werden diese in das bereits bestehende MSP übernommen, was zur Folge hat, dass der Bibliothekseintrag immer genauer auf das Isolat zugeschnitten wird. Für die Handhabung der Isolate, die als MSP-Einträge vorgesehen sind, wurde ein Softwaremodul für die interne Laborsoftware entwickelt. Innerhalb dieses Projektes wurde somit nicht nur eine Arbeitsanweisung erstellt, sondern auch die digitale Infrastruktur geschaffen, die notwendig ist, um die Untersuchungen und Ergebnisse zu dokumentieren, die für entsprechende Datenbankeinträge erforderlich sind.

Stand: