Mikrobiologische Untersuchung von Kühlschmierstoffen mittels kultivierungsabhängiger und -unabhängiger Verfahren

Status:

abgeschlossen 03/2010

Zielsetzung:

- Entwicklung von Standardmethoden zum Nachweis, zur Identifizierung und zur Quantifizierung von Bakterien in Kühlschmierstoffen.
- Besonderer Schwerpunkt auch auf den Nachweis und die Quantifizierung von pathogenen Mikroorganismen, speziell Mykobakterien.
- Molekularbiologische Untersuchung der mikrobiellen Diversität, da mittels kultivierungsabhängiger Verfahren nicht alle in einer Probe vorkommenden Bakterien erfasst werden können.
- Durchführung weiterer kultivierungsabhängiger Tests (z. B. Bestimmung der koloniebildenden Einheiten, Untersuchung physiologischer Eigenschaften), um einen Vergleich der Methoden zu erhalten und feststellen zu können, inwieweit die Diversität tatsächlich erfasst werden konnte.
- Entwicklung eines Standardverfahren, um Mykobakterien in Kühlschmierstoffen nachzuweisen und zu quantifizieren.
- Entwicklung einer zuverlässigen und schnellen Methode zum Nachweis pathogener Arten in Kühlschmierstoffen, um das Risiko der Beschäftigten abzuschätzen und Maßnahmen zur Vermeidung von durch Mykobakterien und andere pathogene Bakterien hervorgerufene Krankheiten treffen zu können.

Aktivitäten/Methoden:

Die heutigen Standardverfahren zu bakteriologischen Untersuchungen in Kühlschmierstoffen sind meistens kultivierungsabhängig, d. h. der Nachweis und die Identifizierung von Mikroorganismen erfolgen über die Kultivierung der Probe auf unterschiedlichen Nährmedien. Auf diese Weise wird aber immer nur ein Teil der Organismen erfasst, es erfolgt also eine Selektion, und damit werden Aussagen über die tatsächliche Diversität in der Probe verfälscht. Aktivitäten/Methoden dieses Forschungsvorhabens:
- Anwendung von vorrangig kultivierungsunabhängigen Verfahren zur Untersuchung der bakteriellen Diversität in Kühlschmierstoffen, um festzustellen, welche Bakterien tatsächlich in diesem Habitat wachsen können.
- Entwicklung einer Methode auf der Grundlage der real-time-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mykobakterien, die dann in Zukunft standardmäßig angewendet werden kann.

Ergebnisse:

Die mikrobiologische Diversität von zehn Kühlschmierstoffproben und sieben Ansetzwasserproben wurde untersucht. Die Proben stammten aus fünf Betrieben, als Mineralöl-Basis dienten insgesamt fünf Kühlschmierstoffprodukte. Insgesamt konnten für die Kühlschmierstoffproben Gesamtzellzahlen (Bakterien) zwischen 7,6 x 10⁴ und 1,6 x 10⁸ Zellen pro ml und Gesamtkoloniezahlen (KBE) zwischen zwischen 0 und 8,1 x 10⁸ KBE / ml (CASO-Medium) ermittelt werden. Für das Ansetzwasser konnten Gesamtzellzahlen von 4,6 x 10² bis 7,8 x 10⁷ GZZ pro ml und Gesamtkoloniezahlen von 7,7 x 10¹ bis 2,2 x 10⁵ KBE/ml (CASO-Medium) detektiert werden.

70 Isolate und 753 Klone (kultivierungsunabhängige Untersuchung der Proben) wurden aus den Proben gewonnen und mittels 16S rRNA Gensequenzierung identifiziert. 45 der Isolate wurden zusätzlich durch physiologische Tests einzelner Gattungen und Arten zugeordnet. Es konnte in den Kühlschmierstoff- und Ansetzwasserproben eine hohe Diversität festgestellt werden. Insgesamt wurden durch die Sequenzierung 98 Gattungen detektiert, durch physiologische Tests konnten weitere 21 Bakteriengattungen in den Proben nachgewiesen werden. Nur sechs der mit physiologischen Verfahren nachgewiesenen Arten konnten auch über Isolierung und 16S rRNA Gen-Sequenzierung in den jeweiligen Kühlschmierstoffproben detektiert werden, nur 13 % der über die Klonierung detektierten Gattungen konnten auch über die Isolierung gefunden werden. Aufgrund dieser methodenbedingten Unterschiede sollten stets mehrere Methoden parallel angewendet werden.
Für 20 der untersuchten Isolate wurde Mycobacterium als ähnlichste Gattungszuordnung ermittelt. Die Isolate wurden allerdings teilweise gezielt von Mykobakterien-spezifischen Nährmedien ausgewählt. Über die kultivierungsunabhängige Analyse (Klonierung) konnten dagegen keine Mykobakterien in den Proben nachgewiesen werden.
Die Anzahl an unterschiedlichen Gattungen innerhalb einzelner Kühlschmierstoffe bzw. deren Ansetzwasser schwankte stark (zwischen 3 und 20 Gattungen pro Probe).
Es gab keine Übereinstimmung zwischen den nachgewiesenen Arten im Ansetzwasser und in den jeweils dazugehörigen Kühlschmierstoffproben.
Von den fünf eingesetzten Kühlschmierstoffprodukten (Produkt A - E) zeigten die beiden Produkte, die auf einer Mineralölbasis mit Vorkonservierung beruhten, die höchste Diversität. Bei den beiden Produkten, die auf Mineralölbasis mit Leitkeimflora (Pseudomonas) beruhen, zeigte ein Produkt eine hohe Diversität, im zweiten Produkt wurden dagegen nur 4 Gattungen detektiert. In Produkt E, Syntheseöl ohne Angaben zur Vorkonservierung, wurden nur fünf Gattungen detektiert, mit einer dominanten Gattung (Sphingomonas).
Der größte Teil der detektierten Mikroorganismen wird derzeit als harmlos für den Menschen eingestuft. Dennoch konnten auch potienziell krankheitsauslösende Bakterien nachgewiesen werden. Zu den Mikroorganismen, die in Risikogruppe 2 nach TRBA 466 eingestuft sind, gehören neben bestimmten Mykobakterienarten, z. B. auch Citrobacter freundii, Brevundimonas diminuta, Aeromonas veronii biovar sobria und Pseudomonas alcaligenes. Eine regelmäßige Kontrolle der Kühlschmierstoffe und Vermeidung der Freisetzung von Aerosolen ist wichtig, um den Kontakt der Arbeitnehmer mit potenziell krankheitsauslösenden Bakterien so gering wie möglich zu halten.
Zum schnellen und quantitativen Nachweis von Mykobakterien wurde ein Standardverfahren mittels Real-time PCR entwickelt. Bei diesem Verfahren wird das hsp-Gen der Mykobakterien aus Kühlschmierstoffen amplifiziert. Die Methode funktioniert für die Mehrzahl der Proben, es besteht aber weiterer Forschungsbedarf, um diese Methode zuverlässig für alle Proben einsetzen zu können.

Stand: